การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
ประโยชน์การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
พื้นทีปฏิบัติงาน เครื่องมือ อุปกรณ
อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
การเตรียมชิ้นส่วนพืช
การเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
การเพาะเลี้ยงแคลลัส
การเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอ
การเพาะเลี้ยงโพรโทพลาสต์
การเจริญเติบโตและพัฒนาของพืช
ในสภาพเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
ความรู้ทางด้านการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช


            การเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย หมายถึงการนำเซลล์เดี่ยว ๆ (single cell) หรือ กลุ่มเซลล์ขนาดเล็ก (aggregate cells) มาเลี้ยงในอาหารเหลว เนื้อเยื่อที่เหมาะที่สุดที่จะใช้คือ แคลลัสที่มีการเกาะตัวของเซลล์อย่างหลวม ๆ (friable callus) ซึ่งง่ายต่อการแยกหรือกระจายเซลล์ออกจากกัน ในการศึกษาเพื่อวัตถุประสงค์จำเพาะอาจใช้เซลล์ของเนื้อเยื่อมีโซฟิลล์จากใบ แต่ต้องย่อยเนื้อเยื่อเสียก่อนด้วยเอ็นไซม์เพคติเนส (pectinase) ความเข้มข้น 0.25 % หรือ สารละลายโปแตสเซียมเดกแทรนซัลเฟต (potassium dextran sulfate) ความเข้มข้น 1 % โดยทั่ว ๆ ไปแล้วไม่แนะนำให้เลี้ยงเซลล์แขวนลอยเป็นเวลานาน เนื่องจากอาจเกิด การเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมไปด้วย
การเลี้ยงเซลล์แขวนลอยมักนิยมเลี้ยงโดยการนำเอาแคลลัสที่เกาะตัวกันหลวม ๆ มาเลี้ยงในอาหารเหลว โดยภาชนะที่ใช้เลี้ยงบนเครื่องเขย่า เมื่อเลี้ยงได้ประมาณ 2 - 3 สัปดาห์ ก็จะได้เซลล์แขวนลอยซึ่งประกอบไปด้วย เซลล์เดี่ยวที่เรียกว่า free single cell และเซลที่เกาะกันเป็นกลุ่มที่เรียกว่า Agregat cell การรักษาหรือขยายปริมาณเซลล์แขวนลอยไปเรื่อย ๆ ทำได้โดยการเปลี่ยนอาหารทุก ๆ 2 - 3 สัปดาห์ ขึ้นอยู่กับปริมาณของเซลล์และชนิดของพืชที่เลี้ยง การเจริญเติบโตของเซลล์แขวนลอยสามารถแบ่งออกไดเป็น 6 ระยะ คือ Leg phase, Exponential phase, Linear phase, Progressive phase, Stationary phase และ Declination phase การเปลี่ยนอาหารควรทำในระยะ progressive phase หรือ deceleration phase เพราะว่าในระยะนี้เซลล์เริ่มลดการแบ่งตัว หมายถึงอาหารเริ่มหมดการเปลี่ยนอาหารในระยะนี้จะทำให้ไม่ต้องเสียเวลาในการเริ่ม Leg phase ใหม่และประหยัดค่าสารเคมีที่ใช้เป็นอาหารวิทยาศาสตร์ จากการศึกษาพบว่า การเจริญหรือการแบ่งตัวของเซลล์แขวนลอยจะเป็นแบบ symchronous growth คือ มีการเจริญหรือแบ่งตัวพร้อมกัน และหยุดพร้อมกันด้วย เช่น เซลล์มีการแบ่งตัวเวลา 11.00 น. แต่ในเวลาอื่นไม่พบการแบ่งตัวของเซลล์เลย

ลักษณะรูปร่างเซลล์แขวนลอย
เซลล์แขวนลอยประกอบด้วยเซลล์เดี่ยวและกลุ่มเซลล์ในสัดส่วนต่าง ๆ กัน มีขนาดและรูปร่างหลายแบบ เช่น Phaseolus vulgaris ประกอบด้วยเซลล์รูปร่างกลมเป็นส่วนใหญ่ มีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางตั้งแต่ 12 - 40 ไมโครเมตร นอกจากนี้ยังพบเซลล์รูปร่างคล้ายรองเท้าแตะขนาด 30 - 60 x 10 - 12 ไมโครเมตร และเซลล์รูปคล้ายขวดน้ำเต้าขนาด 95 x 40 ไมโครเมตร เป็นต้น การที่เซลล์มีรูปร่างผิดปกติจากที่ควรเป็นเซลล์รูปร่างกลมนั้น อาจเนื่องจากการเปลี่ยนแปลงของโครโมโซม เช่น การเพิ่มพลอยดี (ploidy)
สำหรับขนาดและลักษณะการอยู่กันเป็นกลุ่ม ๆ หรือเดี่ยว ๆ ขึ้นกับองค์ประกอบชนิดและความเข้มข้นของอาหาร โดยเฉพาะอย่างยิ่งสารควบคุมการเจริญเติบโต เช่น เซลล์แขวนลอยของต้น deadly nightshade เจริญกระจายเป็นเซลล์เดี่ยว ๆ ในอาหารที่มี NAA 2 มก/ล. แต่ถ้าย้ายไปเลี้ยงในอาหารที่ไม่มีการเติม NAA พบว่าเซลล์จะอยู่รวมกันเป็นกลุ่มมากขึ้น เมื่อย้ายเซลล์ใน stationary phase ไปยังอาหารใหม่ กิจกรรมของไซโทพลาสซึมจะกลับคืนมา พบเห็นสายไซโทพลาสซึม (cytoplasmic strand) เพิ่มจำนวนมากขึ้น ตลอดจนเห็นการเคลื่อนที่ของออร์แกนเนลล์ต่าง ๆ ในไซโทพลาสซึม เช่น ไมโทคอนเดรีย พลาสติด ต่อมาเกิดการแบ่งเซลล์ทำให้เห็นเป็นลูกโซ่ของเซลล์ ในที่สุดกิจกรรมของไซโทพลาสซึมจะลดลงเมื่อการแบ่งเซลล์เริ่มหยุด โดยเซลล์ขยายขนาดใหญ่แล้วเริ่มเข้าสู่สเตชันเนอรีเฟส

ลักษณะโครงสร้างของเซลล์แขวนลอย
เซลล์แขวนลอยที่เกาะตัวเป็นกลุ่มหรือแคลลัสจะประกอบไปด้วยเซลล์ที่มี รูปร่างต่างกัน นอกจากรูปร่างที่แตกต่างกันแล้ว ยังพบว่าสารประกอบภายใน ยังต่างกันด้วย ได้มีการศึกษาโดยการตัด (section) แล้วดูด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน พบว่า เซลล์ที่เกาะตัวเป็นกลุ่มหรือแคลลัสจะมีความผันแปร (variation) มาก กล่าวคือ เซลล์ที่อยู่ตรงกลางของกลุ่มเซลล์หรือแคลลัสกับเซลล์ที่อยู่บริเวณรอบนอกจะมีความแตกต่างกัน และ พบว่าเซลล์ในแคลลัสกับเซลล์ในกลุ่มเซลล์แขวนลอยจะมีลักษณะคล้ายกัน คือ เซลล์ที่อยู่ในระยะ stationary phase จะมีช่องว่างภายในเซลล์ (vacuole) ใหญ่ ส่วนของไซโตพลาสซึ่มถูกเบียดออกไปอยู่ใกล้ผนังเซลล์ สารภายในเซลล์ชนิดต่าง ๆ มีน้อย เมื่อมีการเปลี่ยนอาหารใหม่ เซลล์จะเริ่มมีการทำงานใหม่ โดยส่วนของไซโตพลาสซึ่มจะเข้มข้นขึ้น ช่องว่างภายในเซลล์จะเล็กลง และกระจายเป็นหน่วยเล็ก ๆ สามารถมองเห็นเอ็นโดพลาสมิ เรคติคูลั่ม (endoplamic recticulum) มากขึ้น นอกจากนั้นยังสามารถเห็นส่วนของไมโตคอนเดรีย (mitochondria) พลาสติด (plastic) โกลไจโบดี้ (Golgibodies) และไรโบโซม (Ribosome) เมื่อเลี้ยงได้ระยะหนึ่งเอ็นโดพลาสมิด เรคติคูลั่มจะเรียงตัวขนาดกับผนังเซลล์ ส่วนของไรโบโซมจะรวมกันเป็นกลุ่มเกิดเป็นโพลีโซม กรู๊ฟ (polysome group) และไรโบโซมจะเกาะติดกับเอ็นโดพลาสมิด เรคติคูลั่ม ทำให้มองเห็นเป็นปุมขึ้น ส่วนของโครมาติน (chromatin) ระยะนี้จะย้อมสีติดดีขึ้น และจะอยู่กระจัดกระจายภายในนิวเคลียส (nucleas) ในระยะโปรเฟส (prohase) ซึ่งเป็นระยะที่เซลล์กำลังจะมีการแข็งตัว พอถึงระยะที่เซลล์แบ่งตัวส่วนของโคมาตินจะเห็นเข้มขึ้น ผนังของนิวเคลียส (nuclear membrane) จะสลายตัวไป หลังจากระยะนี้จะเข้าระยะเมตาเฟส (metaphase) ในระยะนี้โครโมโซมจะ เรียงตัวที่อิเควเตอร์ (equator) หลังจากระยะเมตาเฟสก็จะถึง ระยะอะนาเฟส (anaphase) และเทโลเฟส (telophase) ตามลำดับ ในระยะเทโลเฟสของเซลล์ทั่ว ๆ ไป จะเกิดเซลล์เพลท (cell plate) ตรงกลางเพื่อแบ่งนิวเคลียสออกเป็นสองส่วน แต่เซลล์ในเซลแขวนลอยหรือ แคลลัสจะเกิดเซลล์เพลท ตรงผนังด้านใดด้านหนึ่ง แล้วแบ่งเซลล์ออกเป็นสองเซลล์เกิดเป็น เซลล์ลูก (daughter cell) ขึ้น


วิธีเลี้ยงเซลล์แขวนลอยแบบต่าง ๆ

ประเภทของการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย
ได้แบ่งการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอยออกเป็นสองประเภทใหญ่ ๆ คือ แบชคัลเจอร์ (batch culture) และคอนทินิวอัสคัลเจอร์ (continous culture) แต่ละแบบมีประโยชน์ต่องานวิจัยเฉพาะทางแตกต่างกันไป

แบชคัลเจอร์
เป็นการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบระบบปิด คือ เซลล์มีการเจริญในปริมาตรอาหารที่คงที่ซึ่งมีการเขย่าตลอดเวลาเพื่อให้เซลล์เดี่ยวและกลุ่มเซลล์มีการกระจายสม่ำเสมอ และช่วยให้มี การแลกเปลี่ยนอากาศอย่างเพียงพอ
ระหว่างที่อินคิวเบทนั้นจะมีการเพิ่มจำนวนเซลล์จนถึงจุดสูงสุด (maximum yield) อย่างรวดเร็วในเวลาสั้น ๆ เมื่อถึงจุดนี้อาหารเริ่มขาดแคลนหรือมีปัจจัยอื่น ๆ เช่น การสะสม สารพิษเพิ่มขึ้น ทำให้การเจริญของเซลล์หยุดชะงัก ถ้าต้องการเลี้ยงเซลล์ให้เจริญต่อไปจะต้อง ทำการย้ายไปยังอาหารใหม่ เซลล์จึงเริ่มรูปแบบการเจริญซ้ำเหมือนเดิมอีก

1. สโลว์ลีโรเทติงคัลเจอร์ (slowly rotating culture)
ฟลาสก์ที่ใช้ในการเลี้ยงถูกออกแบบเป็นพิเศษเรียกว่า นิพเพิลฟลาสก์ (nipple flask) เพื่อเลี้ยงเซลล์เดี่ยวและกลุ่มเซลล์ที่ได้จากแครอท ฟลาสก์มีลักษณะเป็นรูปกลมมีแขนยื่นออกมา 8 แขน มีสองขนาด คือ ขนาด 250 มล. และ 1,000 มล. ฟลาสก์แบบนี้ทำให้เซลล์สัมผัสอากาศได้นาน เพราะบางระยะเซลล์จมอยู่ในอาหารเหลว บางระยะเซลล์ค้างอยู่ที่แขนของฟลาสก์ มีการหมุนด้วยความเร็วต่ำ คือ 1 - 2 รอบต่อนาที


2. เชคคัลเจอร์ (shake culture)
เครื่องเขย่าที่ใช้ในเชคคัลเจอร์เป็นแบบออบิทัลแพลทฟอร์มเชคเกอร์ (orbital platform shaker) ซึ่งมีการหมุนเขย่าเป็นวงกลม ในการเลี้ยงเซลล์ของยาสูบ ลักษณะเครื่องเขย่าแบบนี้มีแพลทฟอร์มเป็นแผ่น ซึ่งมีคลิปหลายขนาด เพื่อจับยึดฟลาสก์ขนาดต่าง ๆ มีปุ่มเร่งความเร็วที่สามารถเขย่าได้ในช่วง 60 -80 รอบต่อนาที นิยมใช้ในการเลี้ยงเซลล์แขวนลอยของพืชจำนวนมาก

3. สปินนิงคัลเจอร์ (spinning culture)
สปินนิงคัลเจอร์ประกอบด้วยขวดเพาะเลี้ยงขนาดใหญ่ คือ มีความจุได้ถึง 10 ลิตร แต่ใส่อาหารลงไปเพียง 4.5 ลิตร เนื่องจากต้องนำไปวางบนชั้นที่เอียงทำมุม 45 ๐ ซ กับพื้นและมีแกนเหล็กหมุนด้วยมอเตอร์ด้วยความเร็ว 80 - 120 รอบต่อนาที ตรงปากขวดปิดด้วยจุกสำลีเพื่อแลกเปลี่ยนแก๊ส

4. สเตอร์คัลเจอร์ (stirred culture)
เป็นแบชคัลเจอร์ขนาดใหญ่ จุอาหารเหลวได้ 1.5 - 10 ลิตร ดังนั้นการกระจายตัวของเซลล์และการแลกเปลี่ยนแก๊สทำโดยการอัดอากาศเข้าไปในอาหารหรือใช้แท่งแม่เหล็กกวนอัตราการหมุนของแท่งเหล็กประมาณ 200 - 600 รอบต่อนาที

คอนทินิวอัสคัลเจอร์
เซลล์เจริญในอาหารที่มีปริมาตรคงที่ เมื่อเซลล์เจริญเต็มที่อาหารเก่าจะถูกดูดออกแล้วใส่อาหารใหม่เข้าไปแทน โดยมีสายยางสำหรับให้อากาศสะอาดเข้าออกและสายยางสำหรับนำเซลล์ออกมา ใช้สำหรับเลี้ยงเซลล์เป็นเวลานาน เซลล์ในขวดจะแขวนลอยในอาหารเหลวโดยอาศัยการกวนของแท่งแม่เหล็ก

การวัดการเจริญเติบโตของเซลล์แขวนลอย
โดยปกติการเลี้ยงเซลล์แขวนลอยให้มีการเจริญที่ดี ต้องมีการเปลี่ยนอาหารใหม่เป็นระยะและถี่กว่าการเลี้ยงแคลลัส ขณะเดียวกันมีวิธีวัดการเจริญเติบโตของเซลล์เพื่อตรวจดู ประสิทธิภาพของสูตรอาหารและเทคนิคที่ใช้ การเจริญของเซลล์แขวนลอยสังเกตได้จาก ความขุ่น (turbidity) ของอาหาร การวัดการเจริญของเซลล์แขวนลอยทำได้หลายแบบ ได้แก่

การชั่งน้ำหนักสดของเซลล์ (fresh weight)
ทำโดยนำเซลล์แขวนลอยมากรองให้เซลล์ติดอยู่ที่แผ่นกระดาษกรอง ล้างเซลล์ด้วยน้ำสะอาดเพื่อชะล้างเอาอาหารเหลวที่ติดเซลล์ออก จากนั้นระเหยน้ำออกด้วยเครื่องสูญญากาศแล้วชั่งน้ำหนักสด

การชั่งน้ำหนักแห้งของเซลล์ (dry weight)
ทำเหมือนการชั่งน้ำหนักสด นำเซลล์ที่ติดบนกระดาษกรองไปอบแห้งที่อุณหภูมิ 60 ๐ ซ เป็นเวลา 12 ชั่วโมง จากนั้นทำให้เย็น และเก็บในโถทำแห้ง (desicator) ที่มีซิลิกาเจล แล้วชั่งน้ำหนักแห้ง

การนับจำนวนเซลล์ (cell number)
การเพิ่มจำนวนเซลล์เป็นสิ่งที่บ่งชี้ให้เห็นว่า มีการเจริญเติบโตเกิดขึ้น ปัญหาใหญ่ของการนับจำนวนเซลล์ คือ ต้องแยกเซลล์ที่อยู่กันเป็นกลุ่มก้อนให้หลุดแยกออกจากกันเป็นเซลล์เดี่ยว วิธีการที่ใช้แยกเซลล์ในห้องปฏิบัติการต่าง ๆ ดัดแปลงมาจากเทคนิคของ Brown และ Rickless (1949) คือ ใช้มาเซอติงเอเจนต์ (macerating agent) ช่วยในการแยก มาเซอเรติงเอเจนต์ที่ใช้หลายชนิด เช่น
1. สารละลายโครเมียมไตรออกไซด์ (Chromium trioxide solution) เป็นสารละลายที่ประกอบด้วยกรดโครมิก (chromic acid) หรืออาจใช้สารละลายที่มีส่วนผสมของโครเมียมไตรออกไซด์กับกรดไฮโดรคลอริกในอัตราส่วน 1 : 1 นำเอากลุ่มเซลล์มาแช่ในสารละลายที่อุณหภูมิ 20 ๐ ซ นาน 16 ชั่วโมง
2. อีดีทีเอ (EDTA)
3. เอ็นไซม์เพกทิเนส (pectinase) เพื่อย่อยเพกทินที่ผนังเซลล์
หลังจากใช้มาเซอเรติงเอเจนต์ เพื่อทำให้เซลล์หลุดแยกออกจากกันแล้ว นำเซลล์ที่ทราบปริมาตรแน่นอนไปใส่ในสไลด์นับเม็ดเลือด (haemocytometer slide) เอาแผ่นแก้วปิดสไลด์ ปิดแล้วนับจำนวนเซลล์ เพื่อนำมาคำนวณปริมาณของเซลล์ทั้งหมดตามสูตร
จำนวนเซลล์ต่อชิ้นส่วนพืช = ปริมาตรของมาเซอเรต x จำนวนเซลล์ที่นับได้
ปริมาตรเหนือสไลด์นับเม็ดเลือดต่อกริด จำนวนชิ้นส่วนพืช
กริด = ช่องกลมที่มีตารางสี่เหลี่ยมจัตุรัสในสไลด์นับเม็ดเลือด มีปริมาตรเท่ากับ 0.1 ลบ.มม.

แพคเซลล์วอลลูม (packed cell volume หรือ PCV)
เป็นการนับปริมาณเซลล์แขวนลอยทั้งหมด ซึ่งถูกแรงหมุนเหวี่ยงให้ตกตะกอนที่ก้นหลอดความเร็วที่นิยมใช้คือ 200 ก. เป็นเวลา 5 นาที คิดคำนวณค่าที่ได้เป็นลูกบาศก์เซนติเมตรของเซลล์ที่ตกตะกอนต่อลูกบาศก์เซนติเมตรของคัลเจอร์ ควรทำซ้ำอย่างน้อย 2 ครั้ง และ ค่าที่อ่านได้ควรเท่ากัน

ไมโทติกอินเดกซ์ (mitotic index หรือ MI)
หมายถึง จำนวนเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ทั้งหมด ซึ่งแสดงระยะการแบ่งตัวแบบไมโทซิสให้เห็นในช่วงเวลาที่กำหนด การวัดค่าแบบนี้ทำง่ายแต่วิธีการทำนั้นใช้เวลานาน เนื่องจากต้องนับอย่างต่ำ 500 นิวเคลียสของเซลล์ที่อยู่ในระยะไมโทซิส
เทคนิคการใช้สีย้อมนิวเคลียสเพื่อทำการนับจำนวนทำได้หลายวิธี คือ เช่น การย้อมสีคาร์บอล-ฟุชชิน (carbol-fuchsin) จากค่าไมโทติกอินเดกซ์ ทำให้ทราบว่าบริเวณไหนมีการแบ่งเซลล์มากเรียก growth center ซึ่งบริเวณนี้อาจเจริญไปเป็นรากหรือต้นได้
นอกจากวัดการเจริญของเซลล์แขวนลอยแล้วยังสามารถวัดเมแทบอลิซึมของเซลล์แขวนลอยได้ เช่น ดูอัตราการหายใจ คำนวณค่าดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอ และโปรตีน หาจำนวนคาร์บอนอินทรีย์ทั้งหมดของเซลล์ วัดการสังเคราะห์โปรตีน เป็นต้น

การวัดปริมาณโปรตีน (protein content)
กรองเซลล์ด้วย Whatman glass filter แล้วล้างด้วยแอลกอฮอล์ 70 % ที่กำลังเดือด 2 ครั้ง แล้วนำเซลล์ที่ได้ไปทำให้แห้งด้วยอะซีโตน (acetone) แล้วย้ายไปไว้ในสารละลาย NaOH เข้มข้น 1 M จากนั้นอุ่นที่ 85 ๐ ซ นาน 1.5 ชั่วโมง

การวัดการนำไฟฟ้าของอาหาร (medium conductivity)
จากหลักการที่พบว่าความสามารถในการนำไฟฟ้าของสารละลายอาหารผันแปรผกผันต่อน้ำหนักสดของเซลล์ที่เลี้ยง กล่าวคือ เมื่อปริมาณเซลล์เพิ่มขึ้น การนำไฟฟ้าของสารละลายอาหารที่วัดได้จะลดลง ดังนั้นวิธีนี้จึงเหมาะต่อการติดตามวัดการเจริญเติบโตของเซลล์ในระยะเวลาต่าง ๆ ได้ดี การเปลี่ยนแปลงของการนำไฟฟ้าจะเกิดขึ้นเนื่องจากเซลล์มีการใช้อนุมูลไนเตรท (NO3-) จากสารละลายอาหารไป

การวัดปริมาณดีเอนเอและอาร์เอนเอ (DNA and RNA content) มีขั้นตอนดังนี้
ง ชั่งเซลล์ที่ผ่านการกรองและทำให้แห้งให้ได้ปริมาณ 250 มก. มาทำการ homogenize ด้วยเมทธนอล 85 % ที่ 0 - 2 ๐ซ แล้วปั่นเหวี่ยงเพื่อแยกเก็บตะกอนไว้
ง นำตะกอนมาสกัดด้วย trichloroacetic acid ความเข้มข้น 10 % จำนวน 5 มล. ที่ 2 ๐ซ รวม 3 ครั้ง
ง สกัดด้วยเอทธานอล 90 % อีก 2 ครั้ง แล้วทำให้อิ่มตัวด้วย anhydrous sodium acetate ที่ 2 ๐ซ
ง สกัดด้วยเอทธานอล 95 % ที่ 2 ๐ซ จากนั้นสกัดด้วยสารละลาย เอทธานอล : คลอโรฟอร์ม (3:1) ปริมาตร 1 มล. ที่อุณหภูมิห้องแล้วสกัดด้วยสารละลายเอทธานอล : อีเธอร์ (1:1) ที่อุณหภูมิห้อง
ง ล้างด้วยอีเธอร์ แล้วทิ้งให้แห้งก่อนเก็บไว้ที่ ที่ -20 ๐ซ
ง สกัดด้วยสารละลาย KOH ความเข้มข้น 0.3 M จำนวน 10 มล. ที่ 37 ๐ซ นาน 16 ชั่วโมง แล้วล้างด้วยสารละลาย KOH ความเข้มข้น 0.5 M จำนวน 2 มล. อีก 3 ครั้ง
ง เก็บตะกอนที่ได้ไปทำให้เย็นที่ ที่ 0 ๐ซ ปรับ pH ให้เท่ากับ 1.0 ด้วย perchloric acid แล้วเติมเอทธานอล 95 % ลงไป 2 เท่า เก็บไว้ที่ ที่ 0 ๐ซ นาน 2 ชั่วโมง
ง นำไปตรวจหาปริมาณ RNA ด้วยเครื่อง spectrophotometer ที่ความยาวคลื่น 260 nm
ง ตะกอนที่ได้อีกส่วนหนึ่งนำไปหาปริมาณ DNA โดยการตกตะกอนอีกครั้งด้วย perchloric acid ความเข้มข้น 0.5 M ที่ 70 ๐ซ นาน 20 นาที แล้วจึงนำเข้าเครื่องตรวจวัด

การตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์ (cell viability test) สามารถทำได้หลายวิธี คือ
1. ด้วยกล้องจุลทรรศน์ (light microscope) ตรวจดูว่าเซลล์ยังมีนิวเคลียสและมีการเคลื่อนตัวของไซโตพลาสซึม (cytoplasmic stream) อยู่หรือไม่
2. การใช้สีย้อม (dye exclusion test) สีย้อมที่นิยมใช้คือ Evan's blue, phenosaffranin และ triphenyl tetrazolium chloride (TTC) โดยมีขั้นตอนดังนี้
1) Evan's blue test
ง เตรียมสีย้อม Evan's blue ความเข้มข้น 0.025 % และ phenosaffranin 0.1 % โดยละลายในอาหาร
ง หยดสี 1 หยดผสมกับตัวอย่าง 1 หยด ลงบนกระจกสไลด์แล้วปิดด้วยกระจกปิดสไลด์

2) Triphenyl tetrazolium chloride (TTC) test
ง ละลายสี TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 0.6 % ใน 0.5 M phosphate buffer ที่ประกอบด้วย Na2HPO4 8.9 ก/ล และ KH2PO4 6.8 ก/ล
ง ผสมตัวอย่างเซลล์จำนวน 100 มก. ต่อสารละลายสี TTC 3 มล.ที่ 30 ๐ซ ทิ้งไว้ 15 ชั่วโมงแล้วดูดเอาสี TTC ออก ล้างเซลล์ด้วยน้ำกลั่นนึ่งฆ่าเชื้อ
ง ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ เซลล์ที่มีชีวิตจะติดสีชมพู

ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบฟลูออเรสเซนต์ (fluorescent microscope) ดังนี้
ง เก็บตัวอย่างในอะซีโตน 0.5 % (w/v) และเติมสี Fluorescein diacetate 0.01 % ลงไปในสารละลายเซลล์แขวนลอย เก็บไว้ที่ 4 ๐ซ นานประมาณ 5 นาที
ง นำตัวอย่างไปส่องด้วยกล้องฟลูออเรสเซนต์ เซลล์ที่มีชีวิตจะมีสีเขียวเรืองแสง

ปริมาณเซลล์ที่ใช้ในการเลี้ยง
การเลี้ยงเซลล์แขวนลอยมักได้ทั้งเซลล์เดี่ยวและกลุ่มเซลล์ แต่ควรเลี้ยงเฉพาะเซลล์เดี่ยวเพื่อหลีกเลี่ยงปัญหาเฮเทอโรเจนเนอิตี (heterogeneity) คือ ความแตกต่างทั้งทางด้านขนาด รูปร่าง พันธุกรรม และชีวเคมีของเซลล์ สาเหตุที่เป็นเช่นนี้เพราะชิ้นส่วนของพืชที่นำมาเลี้ยงอาจมีขนาดใหญ่เกินไป จึงมีเซลล์ชนิดต่าง ๆ อยู่ด้วยกัน ทำให้ได้แคลลัสที่เป็นเซลล์เฮเทอโรจีนัส (heterogenous cell) วิธีแก้ปัญหานี้ทำได้โดยให้ใช้ปริมาณอินนอคคูลัมให้น้อยที่สุดเวลา ย้ายเปลี่ยนอาหาร เรียก low density inocula culture เมื่อทำซ้ำไปหลาย ๆ ครั้ง จะได้เซลล์ โฮโมจีนัส (homogenous cell) ซึ่งมีความผันแปรน้อยกว่าเซลล์เฮเทอโรจีนัส
การเริ่มต้นเลี้ยงเซลล์แขวนลอยมักเริ่มจากแคลลัสหนัก 2 - 3 ก. ต่ออาหาร 100 มล. การอินนอคคูเลตครั้งแรกถ้าปริมาณเซลล์น้อยเกินไปเซลล์อาจไม่มีการเจริญ ถ้าปริมาณเซลล์มากพอจะได้เป็นเซลล์แขวนลอย ดังนั้นปริมาณเซลล์น้อยที่สุดทำให้เซลล์มีการเจริญแบ่งตัวเพิ่มขึ้นต่อไปเรื่อย ๆ เรียกว่า minimum effective cell density (MECD) หรือ critical initial cell density ค่า MECD ไม่คงที่ ขึ้นกับชนิดและอายุของเซลล์ ตลอดจนสภาพแวดล้อมที่เลี้ยงเซลล์เพื่อใช้เป็นอินนอคคูลัม เช่น ถ้าใช้อินนอคคูลัมของเซลล์ที่อยู่ในสเตชันเนอรีเฟสกับเซลล์ในลิเนียเฟส พบว่าค่า MECD ของเซลล์ในลิเนียเฟสน้อยกว่าเซลล์ในสเตชันเนอรีเฟส การอินนอคคูเลตเซลล์ต่ำกว่า MECD แล้วไม่มีการเจริญเติบโต อาจเป็นผลทางสรีระภายในแต่ละเซลล์ที่เกิดเนื่องมาจากอาหารที่ใช้เลี้ยง กล่าวคือ อาหารนั้นยังขาดบางสิ่งบางอย่างที่จำเป็นและเซลล์ต้องการ ใช้เพื่อการเจริญ

มีผู้พยายามศึกษาความต้องการสิ่งพิเศษในการเจริญของเซลล์และปรับปรุงหรือเสริมลงในอาหารเลี้ยงเพื่อกระตุ้นให้มีการแบ่งเซลล์เกิดขึ้น จากการศึกษาเป็นเวลาหลายปี ทำให้สรุปผลออกมาได้ว่าเซลล์ที่มีการเจริญเติบโตว่องไวดีจะปล่อยสารที่ช่วยในการเจริญเพื่อกระตุ้นให้เซลล์อื่นแบ่งตัวได้แม้จะมีจำนวนเซลล์ในอาหารน้อย มีหลายเทคนิคที่สามารถใช้ใน การเพาะเลี้ยงเซลล์ที่มีปริมาณน้อย แล้วยังทำให้เซลล์สามารถเจริญเติบโตได้

เนอร์ทิชชูเอฟเฟค (The nurse tissue effect)
ก้อนเนื้อเยื่อแคลลัสที่มีการเจริญเติบโตดี สามารถช่วยเสริมให้เซลล์เดี่ยวเกิด การแบ่งเซลล์ได้ วิธีการศึกษาโดยนำเซลล์เดี่ยววางบนก้อนแคลลัสที่มีกระดาษกรองกั้นอยู่ เซลล์เดี่ยวจะได้รับสารอาหารและสารควบคุมการเจริญเติบโตจากแคลลัส โดยการแพร่ผ่านกระดาษกรองซึ่งมีทั้งสารที่มีจากอาหารเลี้ยงโดยตรงและสารจากก้อนแคลลัส ทำหน้าที่เป็นเนอร์ส (nurse) ให้แก่เซลล์เดี่ยว ทำให้มีการเจริญแบ่งตัวเกิดขึ้น

คอนดีชันมีเดีย (Conditioned media)
เมื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ที่กำลังเจริญเติบโตดีในปริมาณมาก (high cell density) ลงในอาหารใหม่ พบว่าขณะที่เซลล์เหล่านี้ดูดสารอาหารไปใช้ จะปล่อยสารที่ช่วยในการเจริญออกมาสามารถทดสอบได้โดยหลังจากอินนอคคูเลตเซลล์ลงในอาหารแล้วภายใน 48 ชั่วโมง ให้เอาเซลล์เหล่านี้ออกให้หมด อาหารที่เหลือจะมีสารช่วยในการเจริญกลายเป็นคอนดิชันมีเดีย ซึ่งสารนี้จะไปช่วยกระตุ้นการแบ่งเซลล์ของพวกมีจำนวนเซลล์ในอาหารน้อยได้

ประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย

1. เพื่อศึกษาเมตาโบลิซึมของเซลล์ โดยเฉพาะที่เกี่ยวกับการสร้างสาร secondary metabolites การสร้างเอ็นไซม์ สภาพของเซลล์ที่ขาดคลอโรฟิลล์และสารแคโรทีนอยด์ ซึ่งมีประโยชน์อย่างมากในการแยกหรือสกัดเอ็นไซม์และสารเคมีที่เป็นประโยชน์
2. เพื่อศึกษาการทำงานเอ็นไซม์ และการแสดงออกของยีน
3. เพื่อการผลิตเอ็มบริออยด์ (คัพภะ) และโพรโทพลาส เพื่อชักนำให้เป็นต้น



 

สนใจติดต่อสอบถามขอทราบรายละเอียดเพิ่มเติมได้ที่.........
อาคารปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช งานปฏิบัติการวิทยาศาสตร์กลาง
สถาบันวิจัยและฝึกอบรมการเกษตรลำปาง สถาบันเทคโนโลยีราชมงคล
ตู้ ปณ. 89 ต.พิชัย อ.เมือง จ.ลำปาง 5200
โทร.0-5434-2553 ต่อ 285 โทรสาร 0-5434-2550

webmaster